由于該菌可生長(zhǎng)在放線菌 A45 平板中，暫認(rèn)為該菌與放線菌 A45 需相同的生活環(huán)境。對(duì)于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新菌種，如能及時(shí)采取對(duì)其的純化培養(yǎng)和確認(rèn)，可能會(huì)對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)及研發(fā)帶來(lái)有利影響。但該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)停留在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究層面，還需進(jìn)一步進(jìn)行 PCR 測(cè)序?qū)嶒?yàn)，確定該菌真實(shí)身份。
1 儀器
精密電子天平（型號(hào)：PB203-N，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；4℃冰箱（BCD-205E/Y，海爾集團(tuán)）；蘇泊爾微電磁爐 （型號(hào)：C19A01-A，浙江蘇泊爾股份有限公司）；智能生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（型號(hào)：LDZX-50KBS
，上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；無(wú)菌操作臺(tái)（型號(hào)：JB-VS-840U，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；精密試紙（pH 6.4-8.0，上海三愛(ài)思試劑有限公司）；可調(diào)微量鎖緊移液器（型號(hào)：WKYⅣ-5，上海佳音分析儀器廠）；燒杯（50mL、100mL、500mL、1000mL 和2000mL）；量筒（50mL、100mL、250mL 和 1000mL）；錐形瓶（100mL、250mL 和 500mL）；分液漏斗（250mL）；10mL 移液管；紗布；微量移液器和槍頭（20μL，200μL 和 1000μL）；接種環(huán)；酒精燈；脫脂酒精棉；培養(yǎng)皿；玻璃棒。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 未知菌株的發(fā)現(xiàn)
無(wú)菌條件下，培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室保存的放線菌 A45，從中挑取未知菌種進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，挑取純化的單個(gè)菌落，點(diǎn)在密集劃線的正常放線菌 A45 平板上，放培養(yǎng)箱 28℃倒置培養(yǎng) 48h 觀察。
2.2 未知菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
無(wú)菌條件下，挑取未知菌株單個(gè)菌落接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)液，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以 200r/min 28℃振蕩培養(yǎng) 4d。待大部分孢子成熟后，即可用于發(fā)酵培養(yǎng)。按照 8%（20mL）的接菌量接種于新的高氏一號(hào)培養(yǎng)液中，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以 200r/min 28℃振蕩培養(yǎng) 4d。
2.3 抑菌活性物質(zhì)的萃取濃縮
將澄清的發(fā)酵液用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。加入 1/4 體積的有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢韬箪o置 4h，收集有機(jī)相和水相，用濾紙片法檢測(cè)各相萃取液的抑菌活性，將有活性相萃取三次后分別合并。將合并相于 70℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，4℃保存?zhèn)?/span>用。
2.4 活性物質(zhì)的抑菌實(shí)驗(yàn)
2.4.1 濾紙片法
無(wú)菌條件下，用無(wú)菌鑷子夾取直徑為 5mm 的圓形無(wú)菌濾紙片分別放入需檢測(cè)的溶液中，充分浸泡，2h 后取出無(wú)菌風(fēng)干，備用。將活化好的供試菌株密集劃線接種于無(wú)菌平板上，用鑷子夾取風(fēng)干的濾紙片放在接種的平板上。放入培養(yǎng)箱。37℃倒置培養(yǎng) 24h，觀察結(jié)果。
2.4.2 微量肉湯稀釋法
無(wú)菌操作，將制備的濃度相當(dāng)于 0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)肉湯 1∶1000 稀釋后分別加到無(wú)菌 96 孔聚苯乙烯板中的第 1-11 孔，每孔中加 180μl。將不同濃度梯度的粗提物溶液分別加到上述 1-10 孔中，每孔 20μl，第11 孔不加粗提物作為生長(zhǎng)對(duì)照。使第 1-11 孔最終粗 提 物 濃 度 分 別 為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0mg/ml，將 96 孔板密封后置 35℃普通空氣孵育箱中，孵育 24h，用酶標(biāo)儀在 630nm 處檢查吸光度值，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)濾紙片法對(duì)未知菌株發(fā)酵液中有效成分進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液中的有效成分對(duì)多種菌種均有較強(qiáng)的抑制作用，抗菌譜較廣，對(duì)表皮葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果較好，其中傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌和痢疾桿菌吸光度上升幅度趨于一致，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)這三種菌的作用效果相同；表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌雖在8mg/mL 時(shí)所測(cè)的吸光度值開(kāi)始上升且幅度大致相同，但當(dāng)粗提物濃度降到 4mg/mL 時(shí)，吸光度走向偏差增大，可能原因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌而表皮葡萄球菌是革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽(yáng)性菌耐受更強(qiáng)。對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果為 16mg/mL，但枯草吸光度上升的幅度比大腸桿菌大，說(shuō)明枯草芽孢桿菌對(duì)抑菌成分的耐受高于大腸桿菌，猜測(cè)這可能與它細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及芽孢有關(guān)。但同為革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，檢測(cè)的吸光度值差距明顯，我們猜測(cè)芽孢很可能起到了至關(guān)重要的作用。
綜上所述，未知菌株分泌的活性物質(zhì)有較強(qiáng)的廣譜抑菌作用，且乙酸乙酯能有效萃取活性物質(zhì)。但該菌的真實(shí)面目需進(jìn)一步確實(shí)。
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